在北曲杂剧盛行的同时，南戏一直在民间流传，保持质朴的特色。到了成化、弘治年间，由于地域的不同与观众成分的差异，逐渐形成不同的声腔，并日渐兴盛起来。据徐渭《南词叙录》说：“今唱家称弋阳腔，则出于江西，两京、湖南、闽、广用之。称余姚腔者，出于会稽，常、润、池、太、扬、徐用之。称海盐腔者，嘉、湖、温、台用之。惟昆山腔止行于吴中，流丽悠远，出乎三腔之上，听之最足荡人。”沈宠绥在《度曲须知》中指出：“词既南，凡腔调与字面俱南，字则宗洪武而兼祖中州；腔则有海盐、义乌、弋阳、青阳、四平、乐平、太子之殊。”可见在嘉靖以前，南戏的各种声腔已经并存，并且已走出其发源地而四处流播。其中，尤以弋阳腔、海盐腔、余姚腔和昆山腔的影响最大。这些声腔都具有“剧种”的意义。随着南戏诸腔的大盛，北曲杂剧渐成衰落之势。
南曲真正高潮的到来，与魏良辅全面改革昆山腔的成功有直接的关系。魏良辅，字尚泉，豫章（今江西南昌）人，寄居太仓南关，熟谙南北曲，他“愤南曲之讹陋”，决心加以改革。嘉靖年间，他在善唱北曲的张野塘、笛师谢林泉、老作曲家过云适的协助下，吸收海盐、弋阳各腔之长，以及江南民歌小调的某些精华，并融合北曲的演唱技巧和结构严谨的艺术成果，对流行于昆山一带的唱腔进行改造，形成一种耳目一新的昆山腔。新变昆腔在咬字发音上，富有字头、字腹、字尾、开口、闭口、鼻音等种种技巧，喉转声音像蚕丝一样的轻柔婉转，并兼有弋阳、海盐、北曲的韵味，成为一种舒徐凄婉的全新腔，称“水磨调”，引起民间艺人和士大夫的重视，起而效之者甚众，“而北词几废”[18]。不过，改革后的昆山腔当时还只停留在清唱阶段，尚未登上戏曲舞台。后来，音乐造诣很深的昆山人梁辰鱼，率先运用新变昆腔演唱他所创作的《浣纱记》，将昆山腔变成一种戏曲声腔，从而刺激了戏曲创作的发展。随后，便涌现出了《玉玦记》、《红拂记》、《祝发记》、《玉合记》、《香囊记》、《明珠记》等一大批昆腔剧作，掀起了明中叶以后的第一个戏剧高潮。从此，昆山腔日益走向成熟，逐渐形成流派，并取代杂剧占据剧坛的主流地位。当时人便将这种新发展起来的戏曲形式称为传奇。